一、罕见病1型原发性高草酸尿症（PH1）好发于幼儿

    人体机体正常情况下，乙醇酸（glycolate）通过乙醇酸氧化酶（glycolate oxidase，GO），催化产生乙醛酸（glyoxylate），乙醛酸通过丙氨酸-乙醛酸转氨酶（alanine-glyoxylate aminotransferase，AGT），催化产生甘氨酸（glycine）。当AGT活性不存在时，乙醛酸盐转化为草酸盐，形成不溶性草酸钙晶体，积聚在肾脏和其他器官中。1型原发性高草酸尿症（primary hyperoxaluria type 1，PH1）是一种罕见的常染色体隐性遗传病，患者因为AGXT基因突变而缺乏AGT，导致肝脏产生过量草酸盐。草酸盐是人类新陈代谢的不溶性最终产物，以钙盐的形式由肾脏排泄，然而过量的草酸盐经肾脏排泄会累积在肾脏引起肾脏损伤，1型是3种亚型中最严重的类型。在中国儿童原发性高草酸尿症患者中，PH1是最常见的类型，其次是PH3和PH2[1]。

    PH1在美国其患病率约为3/1,000,000；我国人口基数大，虽为罕见病，但在我国可能就有四千名患者；此外，在欧洲每年120,000名活产婴儿中就有1人发病[2]。随着数种基因检测在临床应用逐渐普及，个性化医疗和PH1的临床诊断检定将提升我国PH1诊断率。PH1发病年龄较小，出现症状的中位年龄为4至5岁[1]，由于人体产生过量的草酸盐导致草酸钙结晶（oxalate crystal），幼年临床表现为多发性复发性草酸钙肾结石（oxalate stone）、肾钙质沉着症（有肾小管内和间质性草酸钙沉积）和进行性肾损，最终引起肾梗阻，且通常伴有感染（图1）[3]。PH1患者青年期通常发展为尿毒症，成年期通常进展为终末期肾病，超过50%的PH1患者在30岁以前进展为终末期肾病。部分PH1重症患儿甚至在婴幼儿及儿童期即出现肾功能衰竭，等不到肝脏和肾脏供体进行肝移植的患儿于幼年死亡。因此，在逐年少子化的我国，不得不重视PH1的药物研发。

    PH1治疗方法有限，在肾功能未衰竭阶段，可采取增加液体摄入、给予抑制结晶产生药物等支持治疗手段。发生Gly170Arg和Phe152Ile突变的患者对维生素B6（vitamin B6，即盐酸吡哆醇）反应良好，可予大剂量维生素B6治疗。维生素B6在肝脏内可以转化为AGT辅因子5'-磷酸吡哆醛（PLP），使患者的尿草酸排泄，部分恢复正常甚至完全恢复正常（图2，①）[4]。对已经进入透析的患者可采用增加血液透析频次或血液透析和腹膜透析的联合治疗增加草酸清除。PH1患者最终需进行肝肾联合移植，此为目前唯一的治愈方法，但存在显著病死率以及供体器官短缺和终生免疫抑制治疗等问题。随著RNAi疗法的进展，开启了治疗PH1的新时代（图2）。

二、羟基酸氧化酶1（HAO1）基因是治疗PH1小核酸药物的热门靶点

    小核酸药物公司领头羊Alnylam公司的这款Oxlumo®（Lumasiran）已上市药物[5]，是一款皮下给药的靶向人源羟基酸氧化酶1（hydroxyacid oxidase 1，HAO1）mRNA的siRNA药物。肝脏HAO1基因编码乙醇酸氧化酶（GO），该酶催化乙醇酸向乙醛酸的转化，后者是草酸的前体物质，已证实该通路是草酸生成主要通路之一。Lumasiran通过降解人源HAO1mRNA，减少GO的合成，减少乙醛酸的生成，最终减少草酸盐（oxalate）生成（图3；图2，②）。

    Alnylam公司的这款Lumasiran小核酸药物，采用了增强化学（ESC）策略进行全修饰，即在两条链的5'端和反义链的3'端使用硫代磷酸酯（PS）连接,并保留了2'-O-甲基（2’-O-Me，一种天然核糖）修饰,同时引入了少量的2'-氟（2'-F）修饰，这种选择可能是因为大量使用2'-F修饰可能会增加毒性，这些修饰的变化增强了效力和持续时间,使得以较低的剂量实现所需的药效,并降低给药频率[6]。

    除了这款Lumasiran以外，另一种在临床III期RNAi疗法药物DCR-PHXC，则靶向作用于肝脏特异性乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH，LDHA基因编码A亚型）。在肝细胞的过氧化物酶体中，LDH是负责将乙醛酸盐转化为草酸盐和乙醇酸盐的关键酶（图2，③）[4]。因此，沉默LDHA基因可以减少细胞质内乙醛酸盐向草酸盐的转化。

    2023年初NatureReview of Nephrology期刊发布了来自欧洲的原发性高草酸尿症（PH）临床共识，囊括了基因检查、诊断、婴幼儿患者和Lumasiran此类RNAi疗法。例如满足以下任意一项的患者应接受RNAi的治疗：①基因检查确诊为PH1，基因突变导致的吡哆醇治疗无反应，且eGFR＜30 ml/min/1.73 m2的任何年龄患者；②对于慢性肾脏病（CKD）分期为5D期患者的血浆草酸和乙醇酸水平升高，且怀疑为PH1的患者，可先行开始RNAi治疗，并等待基因检查结果[7]。

    已上市的小核酸药物当中[8]，有数个siRNA是靶向靶基因的3’非编码区（3’-untranslated region, 3’UTR），包括Oxlumo®（Lumasiran）、Leqvio®（Inclisiran）和Onpattro®（Patisiran），分别靶向HAO1、PCSK9和TTR基因的3’UTR。小核酸药物序列设计在3’UTR经常较编码区（coding sequence, CDS）更能解决脱靶（off-target）效应的问题，且3’UTR经常能筛出比CDS区药效更高的小核酸药物。此外，人源HAO1基因的CDS仅长1,113 bp，在CDS设计具有自主知识产权的siRNA或ASO序列的空间很有限，人源HAO1的3’UTR应该要被涵盖在小核酸药物设计之内。故人源化HAO1小鼠模型应亦包括人源化3’UTR，此类模型方能使用已上市Lumasiran作为阳参药。然而，目前国内可取得的人源化HAO1基因敲入稳转模型，涵盖人源HAO1 CDS+3’UTR的较少，售价也较昂贵，约5,000元/只[9]。且大多数的药效评价方式，需要到小鼠实验终点，采集肝脏做mRNA水平的基因敲低验证。

    另有PH1大鼠疾病模型，在部分人源化的AGXT基因中携带D205N突变，1月龄大鼠表现出明显的高草酸尿症（高草酸和结晶尿等疾病）表征[10]，但可惜的是PH1大鼠疾病模型并未具备人源化HAO1 CDS+3’UTR，不适用类似Lumasiran此类靶向人源HAO1的小核酸新药研发的药效评价。

    浙江龙传生物为了解决上述模型的问题，巧妙地结合小鼠尾静脉水动力注射瞬时转染（hydrodynamic injection，HDI）技术，构建了不但过表达CDS+3’UTR且能活体成像实时可视化肝脏过表达的人源HAO1-3UTR-Luc2小鼠模型（图4），此模型交付周期短且经济，有明确的指标。

三、龙传生物构建的一种肝靶向在体可视人源化HAO1转基因小鼠模型的数据展示

1.     实时可视性Luc2讯号

龙传生物实时可视性肝脏人源化HAO1 CDS+3’UTR小鼠模型能表达Firefly Luciferase luc2基因（Luc2），在造模之初到实验终点全流程，体重为20 g的小鼠，每只腹腔注射200 μl的D-Luciferin溶液，通过小动物活体成像仪侦测Luc2讯号，能实现转基因的实时可视性，以及转基因在小鼠肝脏人源化的程度（图5），解决过去质粒DNA瞬转基因小鼠造模个体差异的难点。

2.     人源化瞬转HAO1小鼠模型的Luc2讯号与hHAO1 mRNA水平趋势一致

    龙传生物以人HAO1基因（Genebank ID：NM_017545.3）为参考序列，构建质粒DNA。使用6-7周龄的免疫健全鼠C57BL/6或BALB/c雌鼠，建立实时可视性肝脏人源化瞬转HAO1-3UTR-Luc2小鼠模型，建模7天后以小动物活体成像仪拍摄Luc2讯号（图5），以野生型作为对照组扣除背景值，最大值为2.57 x104和6.01 x 104光强（p/sec/cm2/sr）（表1左）。上午拍摄完恢复饮食与活力后，放回笼盒。

表1、hHAO1-3UTR-Luc2模型Luc2讯号与人源HAO1 mRNA水平

    人源化瞬转HAO1-3UTR-Luc2小鼠模型建模第7天傍晚禁食过夜，隔天一早到实验终点，安乐死小鼠，肝脏组织匀浆后，秤取0.2g的肝匀浆液，以Trizol法提取总RNA，反转录（RT）成1st-cDNA。使用特异性引物扩增cDNA模版，进行qPCR鉴定mRNA水平（与鼠源Actin相对定量），模型组依序为23.2 ± 0.99和25.4 ± 2.97倍的人源HAO1 mRNA水平，显著高于野生型阴性对照，整体趋势与Luc2讯号趋势一致（表1）。

3.     人源化瞬转HAO1小鼠模型血清较野生型呈现肾损伤生化指标

    采小鼠全血分离的血清，以全自动生化检验仪（日立3110）检测肾功能生化指标血尿酸（sUA）、尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）。野生型阴性对照小鼠的sUA值为158.9 μmol/L，模型组小鼠的sUA值平均231.0 ± 31.9 μmol/L；野生型阴性对照小鼠的BUN值为6.58mmol/L，模型组小鼠的BUN值平均8.52 ± 0.077 mmol/L，显著高于阴性对照组；野生型阴性对照小鼠的CREA值为30.2 μmol/L，模型组小鼠的CREA值平均39.75 ± 4.313 μmol/L，人源化瞬转HAO1小鼠模型血清较野生型呈现更高的肾损伤生化指标。

表2、hHAO1-3UTR-Luc2模型血清的肾功能生化指标

    综上所述，龙传生物实时可视性肝脏人源化HAO1-3UTR-Luc2小鼠模型已具有5个的指标（小动物活体成像Luc2讯号、肝脏hHAO1mRNA水平、血清生化肾损伤指sUA、BUN和CREA），在接受甲方委托进行药效评价服务时，能做最优的质控，以及较全面的数据反馈。

    龙传生物的临床前中心药理药效研究平台，正开发更多的动物模型，并提供整体的体内与体外实验服务，欢迎上官网（http://www.longcharmbio.com/serviceitems/info_itemid_3.html）或来电谘询商务经理15968882829。

参考文献

[1] Ge Y., Liu Y., Zhan R., Zhao Z., Li J., Wang Wenying, Tian Y. Genotype and Phenotype Characteristics of Chinese Pediatric Patients with Primary Hyperoxaluria.Human Mutation. 2023 Sep 14;2023:4875680.

[2] Xie X, Zhang X. Primary Hyperoxaluria.N Engl J Med. 2022 Mar 10;386(10):976.

[3]Cochat P, Rumsby G. Primary hyperoxaluria.N Engl J Med. 2013 Aug 15;369(7):649-658.

[4]Erger F, Beck BB. A new era of treatment for primary hyperoxaluria type 1.Nat Rev Nephrol. 2021 Sep;17(9):573-574.

[5] FDA批准Oxlumo（Lumasiran）药物，https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2020/214103lbl.pdf

[6]李琛,司笑,李金波等.小干扰RNA药物的化学修饰及递送系统[J].化学学报,2023,81(09):1240-1254.

[7] Groothoff JW, Metry E, Deesker L, Garrelfs S, Acquaviva C, Almardini R, Beck BB, Boyer O, Cerkauskiene R, Ferraro PM, Groen LA, Gupta A, Knebelmann B, Mandrile G, Moochhala SS, Prytula A, Putnik J, Rumsby G, Soliman NA, Somani B, Bacchetta J. Clinical practice recommendations for primary hyperoxaluria: an expert consensus statement from ERKNet and OxalEurope.Nat Rev Nephrol. 2023 Mar;19(3):194-211.

[8]Sarzani R, Spannella F, Di Pentima C, Giulietti F, Landolfo M, Allevi M. Molecular Therapies in Cardiovascular Diseases: Small Interfering RNA in Atherosclerosis, Heart Failure, and Hypertension.Int J Mol Sci. 2023 Dec 26;25(1) pii: ijms25010328.

[9]B6-hHAO1 mice(Strain NO. T054679)on the GemPharmatech (Nanjing, China) website，https://cn.gempharmatech.com/shop/productDetails/62945.

[10] Zheng R, Li Y, Wang L, Fang X, Zhang J, He L, Yang L, Li D, Geng H. CRISPR/Cas9-mediated metabolic pathway reprogramming in a novel humanized rat model ameliorates primary hyperoxaluria type 1.Kidney Int. 2020 Oct;98(4):947-957.