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龙传生物的实时可视人源化XDH转基因小鼠,助力国内蓝海痛风小核酸药物研发

一、黄嘌呤脱氢酶(XDH)是治疗痛风小核酸药物的热门靶点

    痛风(Gout)影响0.6%的世界人口,临床症状包括痛风关节炎、高尿酸血症(hyperuricemia)以及痛风性肾炎等症状。黄嘌呤脱氢酶(xanthine dehydrogenaseXDH)是一种含钼的羟化酶,可催化黄嘌呤产生尿酸(图1),是血清尿酸(sUA)的主要来源。高尿酸血症不仅是痛风的主要原因,也是糖尿病、慢性伤口、心血管疾病、阿尔茨海默病等的病因之一[1]


    然而,目前FDA批准用以降尿酸达到痛风治疗目的药物别嘌呤醇(Allopurinol)、非布司他(Febuxosta)、苯溴马隆(Benzbromarone)和托匹司他(Topiroxostat)等XDH抑制剂却有致命的副作用[2]。例如最常使用的别嘌呤醇虽然价格低廉且有效,但存在肾毒性的风险,且可引起Stevens-Johnson综合征、中毒性表皮坏死松解症、嗜酸性粒细胞增多和药物超敏反应综合征(DRESS)等不良反应[3];非布司他2019年受到FDA黑框警告,其具有4.3%心血管死亡率;苯溴马隆曾因肝坏死不良反应事件被欧洲退市。故需要开发新型药物如靶向XDHsiRNA小核酸药物,因应临床未满足治疗的需求。

    小核酸药物研发领头羊的Alnylam公司,开发的ALN-XDH是一款皮下注射靶向XDH N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)偶联的的siRNA小核酸药物,旨在通过沉默人类肝脏的XDH来治疗痛风,该药在2022年初启动了1/2期临床试验[4],可惜的是据Alnylam公司20232月报导,已停止ALN-XDH治疗痛风的管线。国际制药公司ArrowheadHorizon公司达成全球合作和许可协议共同开发ARO-XDH(亦称HZN-457[5],于202212月启动了1期临床试验;上海舶望制药公司(Argo Biopharma)也开发了XDH管线[6]。综上,XDH是治疗痛风小核酸药物的热门靶点,被赋予巨大的期望,通过半年皮下注射一针,以解决部分痛风患者需要终身服药的不便。


二、现有的应用于小核酸药物药效评价的人源化XDH小鼠模型多需要在动物生物安全二级实验室建模

    Arrowhead和上海舶望公司在专利中揭露其靶向XDH小核酸药物的小鼠体内药效评价皆使用了XDH-GLuc AAV8小鼠模型[5-6]AAV8是具有肝脏组织特异性的AAV病毒(Adeno-associated virus)血清型,所建立的是一种肝靶向的瞬转小鼠模型,通过腺相关病毒AAV8包裹GLuc荧光报导基因和人源XDHhXDH)基因。又由于人源XDH编码基因序列(CDS)长度大于4 kb,已超过AAV病毒包装外源基因的最大容许长度,mRNA还包含5’3’UTR,则总长度5.7 kb,故需要把XDH切成两段(nt 80-2899nt 2820-5717)进行AAV8病毒包装[4]。收集细胞液后再通过超高速离心收集纯化和浓缩XDH-GLuc AAV8病毒,根据国家卫生健康委员会制定的人间传染的病原微生物目录[7]AAV感染动物实验应于动物生物安全二级实验室(ABSL-2)操作(表1,然而仅有少数的单位具备ABSL-2资质与设施。

 


    一般是通过尾静脉注射至少1 x 1011 viral particle/XDH-GLuc AAV8病毒感染小鼠进行造模,造模后2周,皮下注射369 mpk剂量的siRNA药物进行小鼠体内药效评价,在给药前、给药后7天和14天收集血液。通过Gaussia luciferase glow assay试剂盒检测GLuc活性,Arrowhead和上海舶望公司的专利皆通过检测报导蛋白GLuc活性的方法[5-6],间接评价小鼠体内人源XDH mRNAsiRNA药物敲低的程度(表2

 


三、龙传生物构建的一种肝靶向在体可视人源化XDH转基因小鼠模型,基于质粒DNA表达人源XDH,可于SPF实验室构建,不需要于ABSL-2操作

    龙传生物为了解决上述XDH-GLuc AAV8小鼠模型对ABSL-2设施生物安全要求的限制,使用能在小鼠肝脏长期表达的质粒载体,表达人源XDH完整CDS和荧光报导基因Luc2。该模型巧妙地结合小鼠尾静脉注射[8],在低生物安全的SPF实验室建模,使小鼠肝脏组织特异性表达人源XDH蛋白。通过小动物活体成像仪实时监测人源XDH基因的表达情况和通过ELISA检测小鼠血清中的hXDH蛋白表达,到实验终点时通过qPCR检测肝脏内hXDH mRNA、肾脏病理和血尿酸等指标来评估药效。

 

 

四、龙传生物构建的一种肝靶向在体可视人源化XDH转基因小鼠模型的数据展示

1.     实时可视性Luc2讯号

龙传生物实时可视性肝脏人源化XDH小鼠模型能表达Firefly Luciferase luc2基因(Luc2)。在造模之初到实验终点全流程,体重为20g的小鼠,每只腹腔注射200 μl D-Luciferin溶液,通过小动物活体成像仪侦测Luc2讯号,能实现转基因的实时可视性,以及转基因在小鼠肝脏人源化的程度(图2)。

2.     人源化瞬转XDH小鼠模型的Luc2讯号与hXDH蛋白水平趋势一致

    龙传生物XDH基因(Genebank IDNM_000379.4)为参考序列,pLC-Luc2-P2A-hXDH-3xFlag的质粒DNA使用6-7周龄的免疫健全鼠C57BL/6BALB/c雌鼠,建立实时可视性肝脏人源化瞬转XDH小鼠模型。造模后第3天(d3)禁食不禁水过夜,d4一早腹腔注射200 μl D-Luciferin溶液,以小动物活体成像仪拍摄Luc2讯号(图2),以野生型(B6 WT)作为对照组扣除背景值,依序为9.9x1071.3x1071.8x108光强(p/sec/cm2/sr)。拍摄完恢复饮食与活力后,放回笼盒。

    人源化瞬转XDH小鼠模型d5傍晚禁食过夜,d6一早眼眶采血保留小鼠活体,分离血清且10倍稀释后,以人源XDH ELISA试剂盒检测蛋白水平,其人源XDH蛋白浓度依序为1688.5 ± 26.771034.9 ± 147.681554.3 ± 229.97 pg/ml(图3)。其趋势与Luc2讯号一致,故Luc2讯号能反映人源XDH的蛋白水平。

 

3.     人源化瞬转XDH小鼠模型的血尿酸与肝脏hXDH mRNA水平

    人源化瞬转XDH小鼠模型于d13禁食过夜,隔天一早即两周(2W)到实验终点,安乐死小鼠。采小鼠全血分离的血清,以全自动生化检验仪(日立 ,3110)检测血尿酸(UA),野生型(阴性对照组)小鼠UA值为173.30 μm/ml,人源化瞬转XDH小鼠模型UA值依序为240.70282.10273.20 μmol/L。美国风湿性关节炎学会定义,人类尿酸值的正常范围是男性149-416 μmol/L,女性是89-375 μmol/L,当男性 ≥ 416 μmol/L 和女性  375 μmol/L,可确诊为高尿酸血症,为痛风的风险之一。然而,啮齿类动物因体内有尿酸酶,尿酸水平较人类低,故此人源化瞬转XDH小鼠模型UA值为265.33 ± 21.792 μmol/L高于阴性对照组,仍具有参考意义。

    人源化瞬转XDH小鼠模型的肝脏组织匀浆后,称取0.2g的肝匀浆液,以Trizol法提取总RNA,反转录(RT)成1st-cDNA。设计特异性引物,首先以序列为5’-CAAGTTCACCACCCTGTGTGTC-3’的正向引物,其位于人源XDH编码区序列的nt 3936-3957,序列跨越的第3536个外显子(exon),可特异性地扩增cDNA模版,而避免扩增基因组(genomicDNA模版;其次以造模质粒的Flag标签为反向引物,序列为5’-GTCCTTATCGTCGTCATCTTTGTAATCC-3’。进行qPCR,鉴定mRNA水平(与鼠源Actin相对定量),模型组依序为504.5 ± 47.41165.6 ± 20.44394.4 ± 38.80倍的人源XDH mRNA水平(图4)。

 

4.     人源化瞬转XDH小鼠模型2周后有近似临床痛风性肾炎的病理特征

阴性对照小鼠2W肾脏HE染色结构清晰,可见皮质区和髓质区,肾小球结构未见异常,肾小管结构清晰,近曲小管上皮细胞可见刷状缘,未见炎症细胞浸润(图5A左)。然而,人源化瞬转XDH模型组小鼠2W肾脏HE染色,可见小鼠肾脏结构清晰,可见皮质区和髓质区,部分肾小球水肿,肾小管结构清晰,近曲小管上皮细胞可见刷状缘,可见局部小灶性炎症细胞浸润,有近似临床痛风性肾炎的病理特征(图5A右)。类似的结果于肾组织Masson染色并做评分,野生型小鼠对照组评为1分,具有轻度损伤(图5B左);然而,人源化瞬转XDH小鼠模型组评为2分,具有中度损伤(图5B右)。